Characterization and cytotoxic activity on glial cells of alkaloid-enriched extracts from pods of the plants Prosopis flexuosa and Prosopis nigra (Fabaceae) / Caracterización, y actividad citotóxica en células gliales, de extractos enriquecidos con alcaloides de vainas de las plantas Prosopis flexuosa y Prosopis nigra (Fabaceae)

Introduction: Prosopis spp. pods have shown to be a potential source of protein and energy in livestock. However, prolonged ingestion of some of these species produces neurological symptoms in ruminants. Objective: In the present study, the alkaloid content and the in vitro neurotoxic activity of alkaloid enriched-extracts from P. flexuosa and P. nigra pods were determined in order to elucidate the mechanism of animal poisoning caused by these species. Methods: The main alkaloids present in both extracts were analysed by high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (HPLC-HRMS). The cytotoxic activity of Prosopis alkaloid enriched-extracts in primary mixed glial cell culture was assessed by phase contrast microscopy and using neutral red, and lactate dehydrogenase (LDH) activity assays. Results: Juliprosine and juliprosopine were identified in P. flexuosa pods, while the absence of these alkaloids in P. nigra was confirmed. Both extracts (5-30 μg/mL) induced in a dose dependent manner, morphological alterations, such as swelling, enlargement and detachment from the culture surface. Consistent with this, decrease in cell viability and release of LDH 48 hours after exposure, revealed that P. flexuosa pods was significantly more cytotoxic than P. nigra. Conclusions: In P. flexuosa pods, juliprosine and juliprosopine alkaloids were identified for the first time. Moreover, the present study suggests that the cytotoxic effect displayed by both extracts is due to its alkaloid content. However, the presence of piperidine alkaloids in P. flexuosa could explain the greater cytotoxicity on glial cells with respect to P. nigra that was not shown to contain these alkaloids.

Introducción: Las vainas de diversas especies de Prosopis muestran ser una potencial fuente de proteínas y energía para el ganado. Sin embargo, la ingestión prolongada de algunas de estas especies produce síntomas neurológicos en los rumiantes. Objetivo: En el presente estudio se determinó el contenido de alcaloides y la actividad neurotóxica in vitro de los extractos enriquecidos con alcaloides obtenidos en las vainas de P. flexuosa y P. nigra, con el fin de dilucidar el mecanismo de la intoxicación animal causada por estas especies. Métodos: Los principales alcaloides presentes en ambos extractos se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento-espectrometría de masas de alta resolución (HPLC-HRMS). La actividad citotóxica de los extractos enriquecidos con alcaloides de Prosopis se determinó en cultivos primarios de células gliales mixtas y se evaluó mediante microscopía de contraste de fase y utilizando ensayos de actividad de rojo neutro y de deshidrogenasa láctica (LDH). Resultados: Se identificaron la juliprosina y la juliprosopina en las vainas de P. flexuosa, mientras que se confirmó la ausencia de estos alcaloides piperidínicos en P. nigra. Ambos extractos (5-30 μg/mL) indujeron, de manera dependiente a la dosis, alteraciones morfológicas, como hinchazón, agrandamiento y desprendimiento de la superficie de cultivo. En consecuencia, la disminución de la viabilidad celular y la liberación de la LDH después de 48 horas de exposición, reveló que las vainas de P. flexuosa eran significativamente más citotóxicas que las de P. nigra. Conclusiones: El presente estudio muestra la presencia de los alcaloides juliprosina y juliprosopina en vainas de P. flexuosa y sugiere que el efecto citotóxico mostrado por ambos extractos se debe al contenido de alcaloides. Sin embargo, la presencia de estos alcaloides piperidínicos en P. flexuosa podría explicar la mayor citotoxicidad en las células gliales con respecto a P. nigra que no mostró que tuviera estos alcaloides.

Detection of swainsonine and calystegines in Convolvulaceae species from the semiarid region of Pernambuco / Detecção de swainsonina e calisteginas em espécies de Convolvulaceae da região semiárida de Pernambuco

Numerous plant species worldwide including some Ipomoea (Convolvulaceae) and Sida (Malvaceae) species in Brazil cause lysosomal storage disease in herbivores and are known to contain swainsonine and calystegines as the main toxic compounds. The aim of this work was to determine swainsonine and calystegines concentrations in species of Convolvulaceae from the semiarid region of Pernambuco. Seven municipalities in the Moxotó region were visited and nine species were collected and screened for the presence of swainsonine and calystegines using an HPLC-APCI-MS method. The presence and concentration of these alkaloids within the same and in different species were very variable. Seven species are newly reported here containing swainsonine and/or calystegines. Ipomoea subincana contained just swainsonine. Ipomoea megapotamica, I. rosea and Jacquemontia corymbulosa contained swainsonine and calystegines. Ipomoea sericosepala, I. brasiliana, I. nil, I. bahiensis and I. incarnata contained just calystegines. The discovery of six Ipomoea species and one Jacquemontia species containing toxic polyhydroxy alkaloids reinforces the importance of this group of poisonous plants to ruminants and horses in the semiarid region of Pernambuco. Epidemiological surveys should be conducted to investigate the occurrence of lysosomal storage disease associated to these new species.(AU)

Numerosas espécies de plantas em todo o mundo, incluindo algumas espécies de Ipomoea (Convolvulaceae) e Sida (Malvaceae) no Brasil, causam doença de armazenamento lisossomal em herbívoros e são conhecidas por conterem swainsonina e calisteginas como princípios tóxicos. O objetivo deste trabalho foi determinar a concentração de swainsonina e calisteginas em espécies de Convolvulaceae da região semiárida de Pernambuco. Sete municípios na região do Sertão do Moxotó foram visitados, onde foram coletadas amostras das folhas de nove espécies de Convolvulaceae para avaliação da presença de swainsonina e calisteginas utilizando-se cromatografia líquida com espectrometria de massa. A presença e concentração destes alcaloides nas folhas de plantas da mesma espécie e dentre as espécies foram muito variáveis. Seis novas espécies de Ipomoea e uma espécie de Jacquemontia contendo swainsonina e/ou calisteginas são relatadas neste estudo. Ipomoea subincana continha apenas swainsonina. Ipomoea megapotamica, I. rosea e Jacquemontia corymbulosa continham swainsonina e calisteginas. Ipomoea sericosepala, I. brasiliana, I. nil, I. bahiensis e I. incarnata continham apenas calisteginas. A descoberta de novas espécies de Ipomoea e Jacquemontia contendo alcaloides polihidroxílicos tóxicos reforçam a importância deste grupo de plantas tóxicas para ruminantes e equinos na região semiárida de Pernambuco. Pesquisas epidemiológicas devem ser realizadas para investigar a ocorrência de doença de depósito lisossomal associada a essas novas espécies.(AU)

Detection of Ptaquilosides in different phenologic stages of Bracken fern (Pteridium aquilinum) and analysis of mik samples in farms with hematuria in Tolima, Colombia / Detección de ptaquilósido en diferentes estados fenológicos de "helecho macho" (Pteridium aquilinum) y análisis de muestras de leche en granjas con hematuria en Tolima, Colombia / Detecção da ptaquilosida em diferentes estágios fenológicos da samambaia (Pteridiumaquilinum) e análise de amostras de leite em fazendas com hematúria em Tolima, Colômbia

Bracken fern or "Helecho Macho" (Pteridium aquilinum) is one of the most common weeds in the meadows of the mountain ranges of Colombia. Consumption of this palatable plant by bovines causes a disease known as bovine enzootic hematuria and esophageal neoplasia. The toxic effect of the plant in bovines is caused by the ptaquiloside, main carcinogenic toxin of this plant. In this study, eight samples of Bracken fern in different phenologic stages and 16 milk samples collected in two towns of Tolima, Líbano and Murillo, were analized. In both cases, Highperformance liquid cromatography (HPLC) coupled with Mass Spectrometry (MS) was used. In all Bracken fern samples analized, detectable levels of ptaquilosides were observed, ranging from 23 to 1194 µg/g, with a 342 µg/g mean. No detectable levels of ptaquilosides were found in the milk samples. The results show a great variation in the content of ptaquilosides depending on the phenologic stage and collection site of the plant. It is posible that the reported instability of the ptaquiloside and the processing given to the milk samples could have caused the lack of detection of the compound in milk

El "helecho macho" (Pteridium aquilinum) es una de las malezas más comunes en praderas de la región de cordillera en Colombia. El consumo de esta planta palatable por parte de los bovinos causa una enfermedad conocida como hematuria enzoótica bovina y neoplasias de esófago. El efecto tóxico de la planta en los bovinos es causado por el ptaquilósido, principal toxina carcinogénica de esta planta. En el presente estudio se analizaron ocho muestras en diferentes estados fenológicos del helecho obtenidas en dos municipios del departamento del Tolima (Líbano y Murillo) y 16 muestras de leche de la misma zona. En ambos casos se utilizó como técnica analítica cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) acoplada a espectrometría de masas (MS). En todas las muestras analizadas se observaron niveles detectables de ptaquilósido, con un rango de 23 a 1.194 µg/g y un promedio de 342 µg/g. No se encontraron niveles detectables de ptaquilósido en ninguna de las muestras de leche. Los resultados del estudio muestran la gran variación en el contenido de ptaquilósido dependiendo del estado fenológico de la planta y del sitio de colecta. Es posible que la reportada inestabilidad del ptaquilósido y el tipo de procesamiento dado a las muestras de leche haya ocasionado la no detección del compuesto en las mismas.

A samambaia (Pteridium aquilinum) é uma das ervas daninhas mais comuns nas pastagens na região de cordilheira na Colômbia. O consumo desta planta palatável para os bovinos, causa uma doença conhecida como hematúria enzoótica bovina e neoplasias de esôfago. O efeito tóxico da planta nos bovinos é causado pelo ptaquilosídeo, principal toxina carcinogênica desta planta. No presente estudo foram analisadas oito amostras em diferentes estágios fenológicos da samambaia e 16 amostras de leite obtidas em dois municípios do departamento de Tolima (Líbano e Murillo). Em ambos os casos foi utilizada como técnica analítica a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a espectrometria de massas (MS). Em todas as amostras analisadas foram observados níveis detectáveis de ptaquilosídeo, com um rango de 23 a 1.194 µg/g e uma média de 342 µg/g. Não foram encontrados níveis detectáveis de ptaquilosídeo em nenhuma das amostras de leite. Os resultados do estudo mostram a grande variação no conteúdo de ptaquilosídeo dependendo do estágio fenológico da planta e do local da coleta. É possível que a reportada instabilidade do ptaquilosídeo e o tipo de processamento dado às amostras de leite seja a causa da falta de detecção do composto nas amostras de leite analisadas.

Senecio madagascariensis Poir. (Asteraceae): uma nova causa de seneciose em bovinos no Sul do Rio Grande do Sul / Senecio madagascariensis Poir. (Asteraceae): a new cause of seneciosis in cattle in Southern Brazil

Descrevem-se dois surtos de intoxicação por Senecio madagascariensis Poir. diagnosticados em bovinos em outubro de 2013 na região sul do Rio Grande do Sul. A morbidade foi de 3,2% e de 6,1% respectivamente e a letalidade foi de 100%. Um terceiro caso da intoxicação ocorreu em uma propriedade na qual de 54 bovinos um morreu com sinais clínicos da intoxicação. Em todos os casos, os bovinos estavam em áreas altamente infestas por S. madagascariensis que se encontrava em floração. Os sinais clínicos caracterizaram-se por diarreia, tenesmo, opistótono e emagrecimento progressivo e a morte ocorreu entre 10 e 15 dias após o início dos sinais clínicos. Nas necropsias as lesões eram de edema do mesentério, das paredes do abomaso e do rúmen, e das paredes da vesícula biliar, além de fígado firme e com aspecto marmorizado. Histologicamente havia no fígado proliferação de tecido conjuntivo fibroso, principalmente nos espaços porta, megalocitose e hiperplasia de ductos biliares. A observação de grande quantidade de S. madagascariensis em várias propriedades nos municípios de Arroio Grande, Pedro Osório e Capão do Leão a partir do ano 2013 sugere que esta planta está em pleno processo de adaptação e disseminação nesta região e que outros surtos podem ocorrer nos próximos anos. Os surtos relatados aparentemente resultaram do consumo da planta durante o outono/inverno de 2013, quando a mesma estava já em floração. A quantificação dos alcaloides revelou a presença de 500 µg/g e 4000µg/g de planta seca de alcaloides pirrolizidínicos em duas das três propriedades com casos de seneciose. Acredita-se que a grande quantidade de planta existente nas áreas onde os animais estavam e a quantidade de alcaloides presentes na mesma foram fatores que determinaram a ocorrência dos surtos...

Two outbreaks of Senecio madagascariensis poisoning in cattle occurred in October 2013 in southern Brazil. Morbidity rate ranged were 3.2% and 6.1%, and lethality rate was 100%. A third case of poisoning occurred on a property in which out of 54 cattle one died with clinical signs of intoxication. In all cases, the cattle were in areas highly infested by S. madagascariensis that was in bloom. The clinical signs were diarrhea, tenesmus, opisthotonus, and progressive weight loss. Death occurred between 10 and 15 days after the onset of clinical signs. At necropsy, lesions were edema in the mesentery, in the wall of the rumen and abomasum, and in the walls of the gall bladder; the liver was firm with marbled aspect. Histologically, the liver had proliferation of fibrous connective tissue, especially in portal areas, hepatomegalocytosis, and bile duct hyperplasia. The observation of large number of S. madagascariensis in several farms in the counties of Arroio Grande, Pedro Osório and Capão do Leão reinforces that this plant is in the process of adaptation and dissemination in this region and that other outbreaks may occur in coming years. The cases reported here apparently resulted from the consumption of the plant during the fall/winter of 2013, when it was in bloom. The quantification of alkaloids in S. madagascariensis revealed the presence of 500µg/g and 4000µg/g of pyrrolizidine alkaloids in the dry plant from two properties. It is believed that the large amount of the plant in the areas where the animals were and the amount of pyrrolizidine alkaloids found were factors that contributed to the occurrence of outbreaks...

Doença de depósito lisossomal induzida pelo consumo de Ipomoea verbascoidea (Convolvulaceae) em caprinos no semiárido de Pernambuco / Lysosomal storage disease induced by the consumption of Ipomoea verbascoidea (Convolvulaceae) in goats at northeastern Brazil

The aim of this paper was to reproduce the poisoning of Ipomoea verbascoidea in goats and describe the epidemiological, clinical and pathological aspects of spontaneous poisoning by this plant in Pernambuco. For this, we studied the epidemiology of the disease in seven municipalities in the semiarid region of the State. Three spontaneously poisoned goats were examined and then euthanized and necropsied (Group I). To reproduce the disease, the dried leaves of I. verbascoidea containing 0.02% swainsonine were supplied at doses of 4g/kg (0.8mg swainsonine/kg) to two groups of three animals. The goats in Group II received daily doses of the plant during 40 days and were euthanized on the 41st day of the experiment. Goats from Group III received daily doses of the plant during 55 days and were euthanized on the 120th day of the experiment. Other three goats constituted the control group (Group IV). In experimental groups, the brain lesions were evaluated by histopathology; additionally the cerebellar lesions were evaluated by morphometry, by measuring the molecular layer thickness, the number of Purkinje cells and the area of the cell bodies of these cells. The main clinical signs and microscopic lesions in goats poisoned were similar to those reported by swainsonine containing plants. In goats of GII and GIII, the first nervous signs were observed between 22th and 29th days; clinically, the disease developed by these animals was similar to the spontaneous cases. The goats of GIII did not recover from the neurologic signs. These results show that the consumption of the plant by 26-28 days after observation of the first clinical signs is enough to cause irreversible damage. By morphometric analysis, the molecular layer of the cerebellum of the goats of Group I and III were thinner than those of goats in the control group, and Purkinje neurons were atrophic. It is suggested that these changes are responsible for the neurological picture observed in goats that stop eating the plant and have sequelae of poisoning.

O objetivo deste trabalho foi reproduzir a intoxicação por Ipomoea verbascoidea em caprinos e descrever os aspectos epidemiológicos, clínicos e histopatológicos da intoxicação espontânea por essa planta no Estado de Pernambuco. Para isso, realizou-se o acompanhamento da epidemiologia da doença em sete municípios do semiárido pernambucano. Três caprinos espontaneamente intoxicados foram examinados e, em seguida eutanasiados e necropsiados (Grupo I). Para reproduzir experimentalmente a doença, as folhas secas de I. verbascoidea contendo 0,02% de swainsonina, foram fornecidas na dose de 4g/kg (0,8mg de swainsonina/kg) a dois grupos de três animais. Os caprinos do Grupo II receberam a planta diariamente por 40 dias e foram eutanasiados no 41º dia de experimento. Os caprinos do Grupo III receberam a planta diariamente por 55 dias e foram eutanasiados no 120º dia de experimento. Outros três caprinos constituíram o grupo controle (Grupo IV). Nos grupos experimentais, as lesões encefálicas foram avaliadas por histopatologia e adicionalmente avaliaram-se as lesões cerebelares por morfometria, mediante mensuração da espessura da camada molecular, do número de neurônios de Purkinje e da área dos corpos celulares dessas células. Os principais sinais clínicos e lesões microscópicas foram semelhantes aos previamente reportados em animais intoxicados por plantas que contem swainsonina. Nos caprinos do GII e GIII, os primeiros sinais clínicos foram observados entre o 22º e 29º dia de experimento; clinicamente a doença desenvolvida por esses animais foi semelhante aos casos espontâneos. Nenhum dos caprinos do GIII se recuperou dos sinais neurológicos. Esse resultado evidencia que o consumo da planta por 26-28 dias após a observação dos primeiros sinais clínicos é suficiente para provocar lesões irreversíveis. Pela análise morfométrica, a camada molecular do cerebelo dos caprinos do Grupo I e III eram mais delgadas que às dos caprinos do grupo controle, e os neurônios de Purkinje estavam atróficos. Sugere-se que essas alterações sejam responsáveis pelo quadro clínico neurológico observado nos caprinos que deixam de ingerir a planta e apresentam seqüelas da intoxicação.

Experimental swainsonine poisoning in goats ingesting Ipomoea sericophylla and Ipomoea riedelii (Convolvulaceae)

Ipomoea sericophylla and Ipomoea riedelii cause a glycoprotein storage disease in goats. This paper reports the experimental poisoning in goats by dried I. sericophylla and I. riedelii containing 0.05 percent and 0.01 percent swainsonine, respectively. Three groups with four animals each were used. Group 1 received daily doses of 2g/kg body weight (bw) of dried I. sericophylla (150mg of swainsonine/kg). Goats from this group had clinical signs 36-38 days after the start of ingestion. Group 2 received dried I. riedelii daily doses of 2g/kg of I. riedelii (30mg of swainsonine/kg) for 70 days. No clinical signs were observed, therefore the swainsonine dose was increased to 60mg/kg for another 70 days. Goats from Group 2 had clinical signs 26-65 days after increase in swainsonine dose to 60mg/kg. Group 3 was used as control. In these experiments the minimum toxic dose was 60mg/kg which represents 0.0004 percent of the dry matter in goats ingesting 1.5 percent bw of the dry matter. For goats ingesting 2 percent-2.5 percent bw of dry matter this dose would be 0.00024 percent-0.0003 percent of the dry matter. After the end of the experiment two goats were euthanized and another six were observed for recovery of clinical signs. Four goats that continued to consume swainsonine containing plant for 39-89 days after the first clinical signs had non reversible signs, while two goats that ingested the plant for only 15 and 20 days after the first clinical signs recovered completely. These and previous results indicate that irreversible lesions due to neuronal loss occur in goats that continue to ingest the plants for about 30 days after the first clinical signs. Clinical signs and histological lesions were similar to those reported previously for goats poisoned by swainsonine containing plants. No significant alterations were found in packed cell volume, red and white blood cell counts, hemoglobin and mean corpuscular hemoglobin concentrations, mean...

Ipomoea sericophylla e Ipomoea riedelii causam uma doença de armazenamento de glicoproteínas em caprinos. Este trabalho relata a intoxicação experimental em caprinos por I. sericophylla e I. riedelii contendo 0,05 por cento e 0,01 por cento de swainsonina, respectivamente. Foram utilizados três grupos de quatro animais. O Grupo 1 recebeu doses diárias de 2g/kg peso vivo (pv) de I. sericophylla dessecada (150mg de swainsonina/kg). Os caprinos deste grupo apresentaram sinais clínicos 36-38 dias após o início da ingestão. O Grupo 2 ingeriu diariamente 2g/kg de I. riedelii dessecada (30mg de swainsonina/kg) por 70 dias. Como não foram observados sinais clínicos a dose de suainsonina foi aumentada para 60mg/kg por outros 70 dias. Os caprinos do Grupo 2 apresentaram sinais clínicos 26-65 dias após o aumento da dose de swainsonina para 60mg/kg. O Grupo 3 foi utilizado como controle. Neste experimento, a menor dose tóxica de swainsonina foi de 60mg/kg, que representa 0,0004 por cento da matéria seca, em caprinos ingerindo 1,5 por cento pv de matéria seca. Para caprinos ingerindo 2 por cento-2,5 por cento pv de matéria seca essa dose corresponderia a 0,00024 por cento-0,0003 por cento da matéria seca. Após o final do experimento dois caprinos foram eutanasiados e outros seis foram observados para conferir a recuperação dos sinais clínicos. Quatro caprinos que continuaram ingerindo as plantas contendo suainsonina por 39-89 dias após os primeiros sinais clínicos permaneceram com sinais clínicos irreversíveis, enquanto que dois caprinos que ingeriram as plantas por 15 e 20 dias após os primeiros sinais clínicos se recuperaram totalmente. Estes resultados e os de trabalhos anteriores sugerem que as lesões irreversíveis, devidas à perda neuronal, ocorrem quando os caprinos continuam ingerindo a planta por aproximadamente 30 dias após o início dos sinais clínicos. Os sinais clínicos e as lesões histológicas foram similares às descritas anteriormente...